Vorsichtsmaßnahmen für die Polyacrylamid-Gelelektrophorese

· PolyacrylamidDas Gel muss aus Acrylamidmonomer, Polymerisationsausgangsmaterial, Katalysator und der richtigen Salz- und Puffermischung bestehen.

· Acrylamidund BIS (N,N'-Methylen-Doppelacrylamid) ist die Gelmatrix in Monomerform.

· Ammoniumpersulfat löst den Polymerisationsprozess des Klebstoffs aus. Für die Formulierung des Klebers ist eine in Wasser zubereitete 10 %ige Ammoniumpersulfatlösung erforderlich. Die meisten Informationen deuteten auf die Notwendigkeit einer aktiven Nutzung hin. Allerdings kann die 10 %ige Lösung mehrere Wochen lang bei 4 °C ohne nennenswerten Aktivitätsverlust aufbewahrt werden. Füllen Sie den Kleber auf 10 ml auf und entsorgen Sie ihn, wenn der Kleber nicht mehr zusammenklebt.

Tipp: Der Prozentsatz vonAcrylamidBei der Sequenzierung ist Leim und Proteinleim nicht dasselbe. Wenn Sie vorgefertigte Acrylamid:BIS-Lösung verwenden, stellen Sie sicher, dass Sie die richtige Flasche besorgen.

· TEMED (N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamin) ist ein Katalysator, der in einer braunen Flasche im Kühlschrank aufbewahrt wird. Kurz vor dem Eingießen des Leims hinzufügen.

· Bei der Polyacrylamid-Elektrophorese verwendetes Glas sollte vor und nach jedem Mal gewaschen werden. Nach der Elektrophorese mit einer weichen Bürste und einem Tuch in heißem Seifenwasser waschen, mit destilliertem Wasser abspülen und zum Trocknen stehen lassen.

· Feuchtigkeit und Staub können bei hohlem Polymer entstehen. Reinigen Sie die Glasplatte vor der Elektrophorese mit Glasreiniger und wischen Sie sie mit einer weichen Bürste ab. Mit destilliertem Wasser waschen und gründlich mit einem Papiertuch trocknen. Das Abspülen mit 70 %igem Ethanol vor dem Abwischen mit Papier trägt zur Reinigung bei und beschleunigt das Trocknen. Fügen Sie nacheinander Proben von Acrylamid hinzu: BIS, Wasser, Pufferlösung, Ammoniumpersulfat, TEMED. Gut schütteln und sofort einschenken.

Es ist nicht erforderlich, Polyacrylamid vor der Polymerisation zu entgasen. (Früher wurde Acrylamid in ein Vakuum gestellt, um Blasen zu entfernen, da Sauerstoff die Polymerisation hemmt.)

Probenspitzen für horizontale Klebepunkte.

· Legen Sie ein Stück schwarzes Papier in das untere Feld mit schwarzem Hintergrund, um ein Musterloch zu machen, damit Sie es klarer sehen können.
· Mit Leimtank gefüllter Puffer, direkt über dem Kolloid.
· Wenn die Kante ein Licht hat, schalten Sie das Licht ein und lassen Sie das Licht kolloid scheinen. Ziehen Sie die Probe in die Pipette auf.
· Verwendung eines automatischen Pipettiergeräts.
· In 10-200 mu 1 Flüssigkeitsbewegungspunkt kann an den meisten Punkten der Probe verwendet werden. Für sehr kleine Probenlöcher (weniger als 10 μ1) ist der lange Pipettenkopf, der zum Sequenzieren von Kleber verwendet wird, praktischer.

· Pipettieren Sie gerade in die Probe ein und atmen Sie langsam bewegte Flüssigkeit ein. Die Probe kann mit Glycerin klebrig erscheinen und durch schnelles Pumpen können Luftblasen in den Pipettenkopf gezogen werden.

· Proben nach dem Einatmen des Pipettierkopfes bewegen Sie den Flüssigkeitskopf vorsichtig am Rand des Rohrs oder wischen Sie das Papier ab und saugen Sie den Flüssigkeitskopf aus den Tröpfchen heraus. Achten Sie darauf, die Probe nicht einzusaugen.

Legen Sie die Probe in das Probenloch

· Pipettiergerät, um einen leichten Druck aufrechtzuerhalten und die Proben leicht über den Flüssigkeitskopf zu bewegen.
· Der Pipettierkopf wird etwas höher als die Punktlöcher in den Puffer eingeführt, um einen Überdruck aufrechtzuerhalten. Die Spitze der Pipette kann in ein kleines Loch eingeführt werden.
· Führen Sie die Proben langsam und gleichmäßig aus. Die Pipettenspitze wird über dem Punktprobenloch platziert und die Probe sinkt in das Loch. Lassen Sie die Probe sinken, um das Probenloch zu füllen, anstatt sie hineinzudrücken.
· Sobald der letzte Tropfen der Probe mit dem Flüssigkeitskopf erreicht ist, bewegt sich die Flüssigkeit zum zweiten Bein, hebt die Flüssigkeit langsam an und bewegt sich aus dem Puffer

Wie führt man eine vertikale Leimprobenahme durch?

· Vertikale Klebepunkt-Probenlöcher zwischen zwei Glasstücken. Bei sehr dünnem Kleber lässt sich der Pipettenkopf nicht einmal zwischen zwei Glasplatten einführen. Achten Sie auf das Glycerin! Setzen Sie den Pipettenkopf über das Probenloch und die Probe sinkt in das Loch.
Stellen Sie vor der Punktprobe sicher, dass die vertikale Spitze des Polypropylen-Acylgel-Probenlochs sauber gespült wird. Waschen Sie das nicht polymerisierte Acrylamid und das Wasser ab, das möglicherweise am Boden des Probenlochs erscheint. Das Wasser kann das Probenloch deutlich verkleinern. Verwenden Sie eine 25-ml- oder 50-ml-Spritze und eine 18-Gauge-Nadel. Gießen Sie den Elektrophoresepuffer ein und spülen Sie das Probenloch sorgfältig aus.
· Es kann schwierig sein, das Probenloch zu erkennen, aber der Rest ist einfach. Bei zu vielen Löchern kann der Probenpuffer mit Bromphenolblau getestet werden.